細(xi)胞(bao)傳(chuan)代(dai)的(de)步驟(zhou)-貼(tie)壁(bi)細(xi)胞(bao)傳(chuan)代(dai)培養(yang)步驟(zhou)

    傳代(dai)培養(yang)是細(xi)胞(bao)培(pei)養常規(gui)保種(zhong)方(fang)法之壹(yi)，也(ye)是幾乎所有細(xi)胞(bao)生物(wu)學(xue)實(shi)驗的(de)基礎。當(dang)細(xi)胞(bao)在(zai)培(pei)養瓶(ping)中(zhong)長(chang)滿後(hou)就(jiu)需(xu)要將(jiang)其(qi)稀(xi)釋(shi)，分(fen)種(zhong)成多(duo)瓶，細(xi)胞(bao)才(cai)能繼(ji)續生長(chang)。這(zhe)壹(yi)過(guo)程(cheng)就(jiu)叫傳(chuan)代(dai)。傳代(dai)培養(yang)可(ke)獲得大量(liang)細(xi)胞(bao)供(gong)實(shi)驗所需。傳(chuan)代(dai)要在(zai)嚴(yan)格(ge)的(de)無(wu)菌(jun)條件下進行(xing)，每壹(yi)步都(dou)需(xu)要認(ren)真仔細(xi)的(de)無(wu)菌(jun)操作(zuo)。懸(xuan)浮(fu)型細(xi)胞(bao)直(zhi)接(jie)分(fen)瓶(ping)就(jiu)可(ke)以，而貼(tie)壁(bi)細(xi)胞(bao)需(xu)經消(xiao)化(hua)後(hou)才(cai)能(neng)分瓶。本實驗(yan)以(yi)傳代(dai)大鼠(shu)骨髓充(chong)間質幹(gan)細(xi)胞(bao)為(wei)例(li)進行(xing)細(xi)胞(bao)傳(chuan)代(dai)的(de)步驟(zhou)做(zuo)壹(yi)介(jie)紹(shao)。

壹、傳代(dai)前(qian)準(zhun)備(bei)

實驗(yan)開始(shi)前(qian)，將(jiang)無(wu)菌(jun)培養(yang)瓶、15ml 離(li)心(xin)管(guan)、移液(ye)管(guan)、槍(qiang)頭等放入無(wu)菌(jun)超凈(jing)工作臺(tai)，紫外線(xian)照(zhao)射 30min，以進(jin)行(xing)工作臺(tai)的(de)消(xiao)毒。

倒(dao)置(zhi)顯(xian)微鏡(jing)下觀(guan)察(cha)細(xi)胞(bao)形(xing)態，確(que)定細(xi)胞(bao)是否需(xu)要傳代(dai)及細(xi)胞(bao)需(xu)要稀釋(shi)的(de)倍(bei)數(shu)。

二、胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶(mei)/EDTA 消(xiao)化(hua)

    從(cong)培(pei)養(yang)箱(xiang)中取出(chu)待(dai)傳代(dai)的(de)細(xi)胞(bao)，75%酒(jiu)精進行(xing)瓶口(kou)消(xiao)毒，吸掉培養細(xi)胞(bao)的(de)舊培養(yang)基。PBS緩沖(chong)液(ye)洗去(qu)殘留的(de)舊培養(yang)基,重復洗兩(liang)次(ci)。

棄(qi)去(qu) PBS,按每(mei) 25 平(ping)方(fang)厘米(mi) 1ml 消(xiao)化(hua)液(ye)比(bi)例(li)加入消(xiao)化(hua)液(ye)，消(xiao)化(hua)液(ye)中(zhong) EDTA 濃度(du)視(shi)不(bu)同細(xi)胞(bao)而定，骨髓幹(gan)細(xi)胞(bao)貼(tie)壁(bi)特性強(qiang)，比(bi)較(jiao)難於(yu)消(xiao)化(hua)，

可(ke)提(ti)高(gao) EDTA 濃度(du)的(de)方(fang)法，本實驗(yan)采用0.25%胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)加 0.1%EDTA 的(de)消(xiao)化(hua)液(ye)證(zheng)明可以很(hen)好(hao)地消(xiao)化(hua)，並(bing)不(bu)會損(sun)傷細(xi)胞(bao)。放(fang)入顯(xian)微鏡(jing)

下觀(guan)察(cha)，待(dai)所有細(xi)胞(bao)變(bian)圓(yuan)後(hou)立即拿(na)入超(chao)凈(jing)臺(tai)內(nei)，加入 6ml 細(xi)胞(bao)培(pei)養基終止(zhi)消(xiao)化(hua)。消(xiao)化(hua)時(shi)間為(wei) 1-5 分(fen)鐘(zhong)，具(ju)體依細(xi)胞(bao)而異。

采用無菌(jun)吸管(guan)輕(qing)輕(qing)吹(chui)打細(xi)胞(bao)表(biao)面(mian)，註(zhu)意(yi)吹(chui)打全(quan)部(bu)培養表(biao)面(mian)，可以(yi)按照先左右吹(chui)打，後上(shang)下吹(chui)打的(de)方(fang)式(shi)，取(qu)所(suo)有細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)放(fang)入壹(yi)幹(gan)凈(jing)的(de) 15ml 離(li)心(xin)管(guan)內(nei)。每(mei)分(fen)鐘(zhong) 800 轉(zhuan)，室溫(wen)離心(xin) 5min。

三、細(xi)胞(bao)傳(chuan)代(dai)的(de)步驟(zhou)-制(zhi)備(bei)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)及(ji)培(pei)養(yang)  

   吸棄(qi)上清(qing)液，不(bu)要吸到(dao)底(di)部(bu)的(de)細(xi)胞(bao)沈澱。向離心(xin)管(guan)內(nei)的(de)細(xi)胞(bao)沈澱加入適量(liang)培(pei)養基。吹(chui)打混(hun)勻(yun)，吹(chui)打過程(cheng)中(zhong)盡(jin)量(liang)不(bu)要產(chan)生氣泡(pao)。

顯(xian)微鏡(jing)下觀(guan)察(cha)細(xi)胞(bao)分(fen)散情況(kuang)，避免出(chu)現細(xi)胞(bao)成(cheng)團情況(kuang)，確定為(wei)單(dan)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)方(fang)可進行(xing)下壹步操(cao)作(zuo)。本實驗(yan)以(yi) 1:2 的(de)比(bi)例(li)進行(xing)分瓶(ping)，通常(chang)骨髓充(chong)間質幹(gan)細(xi)胞(bao)壹(yi)般(ban)以 1：3 傳(chuan)代(dai)，傳到(dao)第(di) 3 代(dai)時(shi)，骨髓幹(gan)細(xi)胞(bao)的(de)純度(du)可達(da) 95%以上(shang)。將(jiang)培(pei)養瓶放入 37℃，5％CO2 的(de)培(pei)養(yang)箱(xiang)內(nei)繼(ji)續培養。

四、結(jie)果(guo)觀(guan)察(cha)

  第(di)二(er)天可觀(guan)察(cha)細(xi)胞(bao)貼(tie)壁(bi)生長(chang)情況(kuang)，細(xi)胞(bao)培(pei)養換液時(shi)間壹(yi)般(ban)為 2～3d，根(gen)據(ju)細(xi)胞(bao)生長(chang)的(de)狀(zhuang)態和實驗(yan)要(yao)求來確(que)定。待(dai)細(xi)胞(bao)鋪(pu)滿器皿(min)底(di)面(mian)，即(ji)可使用，也可(ke)繼(ji)續傳代(dai)擴大(da)培養(yang)或換成維(wei)持(chi)液(ye)。

懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞(bao)可(ke)以直(zhi)接(jie)將(jiang)培(pei)養瓶中的(de)液(ye)體吸掉，只(zhi)留下少(shao)量(liang)，然(ran)後加入新(xin)鮮培(pei)養液即可。

   當細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)中(zhong)碎(sui)片或顆粒物(wu)較(jiao)多(duo)，感(gan)覺(jiao)到(dao)比(bi)較(jiao)臟(zang)時(shi)，可以(yi)將(jiang)懸(xuan)液(ye)移到(dao)離(li)心(xin)管(guan)內(nei)，1000～1500rpm離(li)心(xin) 3 分鐘(zhong)，棄(qi)上清(qing)，加入約(yue) 2ml 培養(yang)液，吹(chui)打至均(jun)勻(yun)，滴加 2-3 滴(di)至(zhi)已加入新(xin)鮮培(pei)養液的(de)培(pei)養(yang)瓶(ping)中。然後(hou)置(zhi)於(yu)二氧化(hua)碳(tan)培養箱(xiang)中培養(yang)。

五、傳(chuan)代(dai)細(xi)胞(bao)培(pei)養的(de)實(shi)驗(yan)步驟(zhou)及(ji)註(zhu)意(yi)事(shi)項

1、嚴格(ge)無菌(jun)：

傳代(dai)培養(yang)時(shi)要註(zhu)意(yi)嚴(yan)格(ge)的(de)無(wu)菌(jun)操作(zuo)，並(bing)防(fang)止(zhi)細(xi)胞(bao)之間(jian)的(de)交叉汙染。

2、適度(du)消(xiao)化(hua)：

    消(xiao)化(hua)的(de)時(shi)間受(shou)消(xiao)化(hua)液(ye)的(de)種(zhong)類、配(pei)制時(shi)間、加入培(pei)養瓶(ping)中的(de)量(liang)等諸(zhu)多(duo)因(yin)素(su)的(de)影(ying)響，酶(mei)解(jie)消(xiao)化(hua)過(guo)程(cheng)中(zhong)要不(bu)斷(duan)觀(guan)察(cha)，消(xiao)化(hua)過(guo)度(du)會對(dui)細(xi)胞(bao)造(zao)成損(sun)害，消(xiao)化(hua)不(bu)夠則難(nan)於(yu)將(jiang)細(xi)胞(bao)解(jie)離下來。對(dui)於(yu)貼(tie)壁(bi)能(neng)力(li)較(jiao)弱，容易脫(tuo)壁(bi)的(de)細(xi)胞(bao)，可(ke)以不(bu)經蛋(dan)白(bai)酶(mei)原(yuan)消(xiao)化(hua)處(chu)理和終止(zhi)消(xiao)化(hua)這(zhe)兩(liang)步，直(zhi)接(jie)對(dui)原(yuan)代(dai)培養(yang)物(wu)或經(jing)漂(piao)洗(xi)後(hou)用吸管(guan)進行(xing)吹(chui)打使細(xi)胞(bao)脫(tuo)離瓶(ping)皿(min)底(di)壁(bi)。這(zhe)種(zhong)直(zhi)接(jie)吹(chui)大(da)的(de)方(fang)法對(dui)生命力(li)旺(wang)盛(sheng)的(de)細(xi)胞(bao)如(ru)某(mou)些腫瘤細(xi)胞(bao)較(jiao)為合(he)適。高(gao)強度(du)機械(xie)吹(chui)打易對(dui)細(xi)胞(bao)造(zao)成傷害較(jiao)大，細(xi)胞(bao)也(ye)常有較(jiao)大數(shu)量(liang)的(de)丟(diu)失，因(yin)而絕大部分貼(tie)壁(bi)生長(chang)的(de)細(xi)胞(bao)需(xu)消(xiao)化(hua)後(hou)才(cai)能(neng)吹(chui)打，壹般(ban)不(bu)單(dan)獨采用高(gao)強度(du)機械(xie)吹(chui)打。

3、把(ba)握好(hao)消(xiao)化(hua)液(ye)的(de)*佳(jia)濃度(du)：

   消(xiao)化(hua)液(ye)的(de)消(xiao)化(hua)能(neng)力(li)是和溶液(ye)的(de) pH、溫(wen)度(du)、胰酶(mei)濃度(du)及溶(rong)液中(zhong)是否含(han)有 Ca2+, Mg2+和血(xue)清(qing)等因(yin)素(su)有關，實驗(yan)采用 0.25%胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)+0.1%EDTA 的(de)消(xiao)化(hua)液(ye)證(zheng)明可以很(hen)好(hao)地消(xiao)化(hua)骨髓幹(gan)細(xi)胞(bao)。

4、吹(chui)打細(xi)胞(bao)動(dong)作要輕(qing)柔(rou)：

    吹(chui)打時(shi)用力(li)過(guo)猛(meng)會(hui)損傷細(xi)胞(bao)。可(ke)選(xuan)擇用用大口(kou)徑的(de)吸管(guan)或者(zhe)管(guan)口較(jiao)大的(de)壹(yi)次(ci)性耗(hao)材(cai)，減少(shao)對(dui)細(xi)胞(bao)的(de)損(sun)傷。對(dui)貼(tie)壁(bi)細(xi)胞(bao)消(xiao)化(hua)後(hou)的(de)吹(chui)打過程(cheng)要(yao)有序進行(xing)，要從(cong)壹(yi)邊(bian)開始(shi)到(dao)另(ling)壹(yi)邊(bian)結(jie)束(shu)，尤(you)其(qi)是器皿(min)的(de)四角(jiao)處(chu)，確保(bao)瓶皿(min)底(di)壁(bi)各(ge)處(chu)的(de)細(xi)胞(bao)都(dou)被(bei)吹(chui)打脫(tuo)離。

5、傳(chuan)代(dai)次(ci)數(shu)不(bu)宜過(guo)多(duo)：

    傳代(dai)數(shu)是指對(dui)培養(yang)物(wu)傳(chuan)代(dai)的(de)次(ci)數(shu)，它不(bu)等於(yu)細(xi)胞(bao)分(fen)裂的(de)次(ci)數(shu)或細(xi)胞(bao)的(de)代(dai)數(shu)，而僅代(dai)表(biao)傳(chuan)代(dai)操作(zuo)的(de)次(ci)數(shu)。傳代(dai)對(dui)細(xi)胞(bao)的(de)影(ying)響或傷害程(cheng)度(du)僅次(ci)於(yu)將(jiang)活(huo)細(xi)胞(bao)從(cong)生物(wu)體內(nei)取(qu)出(chu)並(bing)進(jin)行(xing)原(yuan)代(dai)培養(yang)的(de)程(cheng)度(du)。只(zhi)是因(yin)為(wei)傳(chuan)代(dai)後的(de)細(xi)胞(bao)生長(chang)並(bing)不(bu)像剛(gang)開始(shi)原(yuan)代(dai)培養(yang)時(shi)那(na)樣緩(huan)慢。每經(jing)過(guo)壹次(ci)傳代(dai)，細(xi)胞(bao)的(de)生長(chang)環(huan)境就(jiu)相應發(fa)生壹次(ci)較(jiao)大變(bian)化。體外生長(chang)的(de)細(xi)胞(bao)若(ruo)處(chu)於(yu)動蕩的(de)生活環(huan)境中，細(xi)胞(bao)的(de)遺(yi)傳(chuan)特性往(wang)往(wang)容易(yi)發生改變(bian)。經過(guo)多(duo)次(ci)傳代(dai)培養(yang)的(de)細(xi)胞(bao)，往(wang)往(wang)容易(yi)轉(zhuan)化為惡性細(xi)胞(bao)。因(yin)此，傳代(dai)對(dui)細(xi)胞(bao)生長(chang)和性狀(zhuang)會產(chan)生不(bu)利影(ying)響，壹(yi)般(ban)情況(kuang)下要盡(jin)可(ke)能(neng)減(jian)少(shao)傳代(dai)次(ci)數(shu)。

       蘇州阿(e)爾法生物(wu)實(shi)驗(yan)器材(cai)有限公(gong)司13年(nian)來(lai)，致力(li)於(yu)生物(wu)科(ke)學(xue)實(shi)驗室(shi)儀(yi)器設備(bei)和生物(wu)試(shi)劑(ji)、實(shi)驗(yan)耗(hao)材(cai)的(de) 供(gong)應(ying)。其(qi)中(zhong) 包括分(fen)子(zi)生物(wu)學(xue)產(chan)品(pin)、蛋(dan)白(bai)質組(zu)學(xue)、組(zu)化(hua)免疫學(xue)、細(xi)胞(bao)生物(wu)學(xue)、生物(wu)工程(cheng)、生物(wu)反(fan)應(ying)器等常用的(de)設備(bei)，生物(wu)試(shi)劑(ji)種(zhong)類齊全(quan)，主(zhu)要(yao)包含(han)壹(yi)抗、二(er)抗、標(biao)簽抗體、轉(zhuan)染試(shi)劑(ji)、 培(pei)養(yang)基、胎(tai)牛(niu)血(xue)清(qing)、 天根(gen)試(shi)劑(ji)盒(he)、DNA提(ti)取試(shi)劑(ji)盒(he)、ELASIA試(shi)劑(ji)盒(he)、質粒提(ti)取 試(shi)劑(ji)盒(he)；實(shi)驗室耗材(cai)有離心(xin)管(guan)、 PCR 管(guan)、PCR八聯管(guan)、96 孔(kong)板、細(xi)胞(bao)培(pei)養板、細(xi)胞(bao)培(pei)養瓶、三(san)角(jiao)搖瓶(ping)、移液(ye)槍(qiang)吸頭、工作站(zhan)吸頭等 上百(bai)余 種實(shi)驗耗(hao)材(cai)，如果(guo)了(le)解更(geng)多(duo)的(de) 細(xi)胞(bao)傳(chuan)代(dai)的(de)步驟(zhou)  可(ke)進(jin)入網站(zhan)咨(zi)詢。