Wetern Blot蛋(dan)白印(yin)跡(ji)實(shi)驗(yan)方法(fa)及步(bu)驟(zhou)

l 1x RIPA 緩沖液(ye)：50 mM Tris、 150 mM NaCl 、0.1% SDS、0.5% 脫(tuo)氧膽酸(suan)鈉、 1% Triton X-100 或 NP40。

l 1x PBS 緩沖液(ye)：137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、2.7 mM Na 2 HPO 4、2.7 mM KH 2 PO 4、 pH 7.4

l BCA 蛋(dan)白檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒(he)或(huo) Bradford 蛋白檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒(he)

l 1.5 M Tris 緩沖液(ye) (pH 8.8)： 90.68 g Tris-HCl 至(zhi) ddH 2 O，使用 HCl 將(jiang) pH 調(tiao)節至(zhi) 8.8，最(zui)後(hou) 500 ml

l 1.0 M Tris 緩沖液(ye) (pH 6.8)：60.58 g Tris-HCl 至(zhi) ddH 2 O，使用 HCl 將(jiang) pH 調(tiao)節至(zhi) 6.8，最(zui)後(hou) 500 ml

l 10% APS：使用前(qian)制(zhi)備的 1 ml ddH 2 O中的(de) 100 mg AP 。

l 10% SDS：10 g SDS 在(zai) 100 ml ddH 2 O 中(zhong)。

l 1x Tris-甘氨(an)酸緩沖液(ye)：Tris配比25 mM；  PH=8.3 的(de)甘(gan)氨(an)酸配比230 mM、 SDS配比0.1% 。

l 3x SDS 蛋(dan)白上(shang)樣(yang)緩沖液(ye)配制(zhi)：使用PH=6.8 的 Tris 150 mM 、SDS添加6% 、甘(gan)油 添加30% 、 EDTA濃(nong)度(du)30 mM 和(he) 溴(xiu)酚藍(lan) 配比0.2% 。緩沖液(ye)應(ying)隨用隨配、分裝冷凍(dong)備用。1x TTBS ： 25 mM Tris（pH 7.5）：0.15 M NaCl 、 0.05% Tween-20、0.001% 硫柳(liu)汞(gong)

l 1x 轉(zhuan)移(yi)緩沖液(ye)：3 g Tris、14.4 g 甘(gan)氨(an)酸和(he) 200 ml 甲醇，添加 ddH 2 O 至(zhi) 1L

l 去(qu)除(chu)上(shang)清(qing)液(ye)並(bing)用 1X PBS 洗(xi)滌(di)以去(qu)除(chu)殘留(liu)培(pei)養(yang)基。

l 添加預(yu)冷的(de) 400 ul-1 ml 1X RIPA 緩沖液(ye)/100 mm 培(pei)養(yang)皿。在冰(bing)上(shang)孵育 5-10 分(fen)鐘。

l 刮(gua)去(qu)細(xi)胞(bao)並(bing)轉(zhuan)移(yi)到(dao)冰(bing)上(shang)預冷(leng)的 1.5 ml 微管中(zhong)。

l （可選(xuan)）均質化或超(chao)聲(sheng)處理(li)。

l 4°C 12,000 rpm 離心(xin) 10-15 分(fen)鐘(zhong)，收集上(shang)清(qing)液(ye)備用。

l 總(zong)蛋(dan)白應(ying)儲(chu)存在 -20°C 直至(zhi)需要。 

l （可選(xuan)）取(qu)出 100 ul 等分(fen)試樣進(jin)行(xing)細(xi)胞(bao)計(ji)數。

l 將(jiang)細(xi)胞(bao)轉(zhuan)移(yi)到(dao)預冷(leng)的(de) 1.5 ml 微(wei)管或(huo) 15 ml 試管中(zhong)，並(bing)在(zai) 4°C 下以 2000 rpm 的速度(du)離心(xin) 5 分鐘(zhong)。

l 取(qu)出培(pei)養(yang)基，用 1 ml 預冷的(de) 1x PBS 重懸沈(chen)澱，然後(hou)轉(zhuan)移(yi)到(dao) 1.5 ml 微管中(zhong)。

l 在(zai) 4°C 下以 2000 rpm 離心(xin) 5 分(fen)鐘。

l 用 1 ml 預冷 RIPA 緩沖液(ye)/10 7 個細(xi)胞(bao)重懸細(xi)胞(bao)沈(chen)澱

l 將(jiang)細(xi)胞(bao)懸液(ye)在(zai)冰(bing)上(shang)搖晃(huang) 30 分(fen)鐘(zhong)。或(huo)均質化/超聲(sheng)處理(li)。

l 4°C 12000 rpm 離心(xin) 10-15 分(fen)鐘(zhong)，收集上(shang)清(qing)液(ye)備用。

l 總(zong)蛋(dan)白應(ying)儲(chu)存在 -20°C 直至(zhi)需要。

l 組(zu)織(zhi)制(zhi)備和(he)定(ding)量。把它們切(qie)成(cheng)小塊。

l 添加約(yue) 500-600 ul 預冷(leng)的 1x RIPA 緩沖液(ye)/100 mg 組(zu)織(zhi)。

l 均勻(yun)組(zu)織(zhi)。

l 在 4°C 下以 12000 rpm 離心(xin) 15-20 分(fen)鐘。

l 收(shou)集上(shang)清(qing)液(ye)備用。

l 總(zong)蛋(dan)白應(ying)儲(chu)存在 -20°C 直至(zhi)需要。

l 在(zai) 1X 轉(zhuan)印(yin)緩沖液(ye)中(zhong)預(yu)潤濕(shi)凝(ning)膠(jiao)、Whatman 紙和(he)海(hai)綿(mian)等(deng)材料。

l PVDF 膜(mo)應(ying)在(zai)甲醇中孵育 10 秒(miao)。至(zhi) 1 分(fen)鐘，然後(hou)移至(zhi) 1X 轉(zhuan)移(yi)緩沖液(ye)。

l 將(jiang)以下材料堆(dui)疊：外殼（黑(hei)色面(mian)）、海(hai)綿、Whatman 紙、凝(ning)膠(jiao)、膜、Whatman 紙、海(hai)綿(mian)、外殼（透明面(mian)）。

l 將(jiang)黑(hei)色面(mian)朝(chao)黑(hei)色放(fang)入(ru)轉(zhuan)印(yin)設(she)備中。

l 在低溫(wen)環(huan)境(jing)中(zhong)，使用轉(zhuan)印(yin)緩沖液(ye)進(jin)行(xing)轉(zhuan)印(yin)操(cao)作。轉(zhuan)印(yin)電(dian)流(liu)和(he)時間(jian)可以根據(ju)實(shi)驗(yan)過程(cheng)和(he)使用說(shuo)明進行優(you)化。

l 壹(yi)抗在(zai) 1X TBST+3% BSA 中(zhong)以推(tui)薦(jian)的(de)稀(xi)釋度(du)稀(xi)釋或根據(ju)結果(guo)優(you)化稀(xi)釋度(du)。

l 在 4°C 下孵育過(guo)夜或(huo)更(geng)長時間(jian)，或在(zai)室溫(wen)下孵育 4 小時。

l 回收壹(yi)抗(kang)並(bing)儲(chu)存在 4°C。然後(hou)在 RT 的(de)振(zhen)動篩上洗(xi)滌(di)膜 3X 5-10 分(fen)鐘(zhong)。

l 在 1X TBST 中(zhong)稀(xi)釋二抗並(bing)將(jiang)膜(mo)在(zai)室溫(wen)下孵育 1 小時或在(zai)振(zhen)蕩(dang)器(qi)上在 4°C 下孵育 2-4 小時。

l 在 RT 的(de)搖床上用 TBST 洗(xi)滌(di) 3X 10 分鐘(zhong)。