實(shi)時熒(ying)光(guang)定量PCR法(fa)進(jin)行(xing)無(wu)乳(ru)鏈(lian)球(qiu)菌血清分型的實驗步(bu)驟(zhou)

實(shi)時熒(ying)光(guang)定量PCR法(fa)進(jin)行(xing)無(wu)乳(ru)鏈(lian)球(qiu)菌血清分型的實驗步(bu)驟(zhou)

B組(zu)鏈球(qiu)菌(GBS) 是(shi)壹(yi)種(zhong)熒(ying)光(guang)檢測帶有包膜的革(ge)蘭(lan)氏(shi)陽性(xing)菌，是(shi)新(xin)生兒(er)侵襲(xi)性(xing)感(gan)染(ran)敗血癥和(he)腦(nao)膜(mo)炎的(de)重(zhong)要原因(yin)，GBS血(xue)清抗(kang)體傳統(tong)分(fen)型法(fa)通常需要經過(guo)乳(ru)膠(jiao)凝(ning)集(ji)、多(duo)重 PCR 和(he)條帶大(da)小分(fen)析或全(quan)基因(yin)組(zu)序列(lie)分析等步(bu)驟(zhou)，過(guo)程繁瑣，技術成(cheng)本(ben)昂(ang)貴，所以(yi)在(zai)PCR實驗室中(zhong)采用實時熒(ying)光(guang)定量PCR 法(fa)進(jin)行(xing)血(xue)清分型不僅可以(yi)替代乳(ru)膠(jiao)凝(ning)集(ji)法(fa)，還(hai)可(ke)以(yi)改(gai)進 GBS 血清型數據(ju)的(de)采集。



GBS 細(xi)菌菌株分(fen)離(li)與培(pei)養
將(jiang)GBS 分(fen)離(li)株在(zai)胰(yi)蛋(dan)白酶大(da)豆 (TS) 或(huo) 5% 羊血瓊脂平板(ban)上於(yu)37°C 培(pei)養(yang)，然後(hou)在(zai) TS 培養(yang)基中於 37°C 培(pei)養過(guo)夜。

通過乳(ru)膠(jiao)凝(ning)集(ji)進(jin)行(xing)血(xue)清分型
根據(ju)制造商(shang)的說明(ming)，使(shi)用 Immulex Latex Agglutination Streptococcus B 試(shi)劑盒(he)（Staten Serum Institute；Copenhagen，Denmark）通過乳(ru)膠(jiao)凝(ning)集(ji)對(dui)所有(you) GBS 分離株進(jin)行(xing)血清分型。簡而言(yan)之，將(jiang) 10 μl 乳(ru)膠(jiao)試(shi)劑添(tian)加(jia)到(dao)懸(xuan)浮在(zai) 10 μl 鹽水(shui)中(zhong)的單個(ge) GBS 菌落中。如果(guo) 30 秒後(hou)可見凝(ning)集，則(ze)旋(xuan)轉(zhuan)反應並解(jie)釋(shi)為陽性(xing)。 

實(shi)時熒(ying)光(guang)定量法(fa) PCR 進(jin)行(xing)血(xue)清分型
設計引(yin)物和(he)探針以擴(kuo)增無乳(ru)鏈(lian)球(qiu)菌每種血清型的多(duo)糖莢(jia)膜(mo)基因(yin)的(de)區別區域(yu)。引(yin)物中(zhong)的寡(gua)核(he)苷酸(suan)未經修(xiu)飾(shi)和(he)脫(tuo)鹽，探(tan)針用熒(ying)光(guang)探針（5' 6-羧基熒(ying)光(guang)素(su) (6-FAM)）和(he)兩(liang)種猝(cu)滅劑(ji)標記(ji)，並通過高壓液相(xiang)色(se)譜(pu)法(fa)純化.

PCR實時熒(ying)光(guang)定量分(fen)析
使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 從 GBS 的過夜(ye)培(pei)養物中(zhong)提取(qu)基因(yin)組(zu) DNA。PCR 反應最終體積(ji)為 20 μl，由 10 μl Taqman Universal Mastermix、7.4 μl 無(wu)菌水、0.2 μl 正向(xiang)引(yin)物（100 μM 原液）、0.2 μl 反向(xiang)引(yin)物（100 μM 原液）、0.2 μl 探針（100 μM 儲備(bei)液）和 2 μl GBS DNA（25 ng/μl）。在(zai) 熒(ying)光(guang)定量PCR儀器上(shang)進(jin)行三次反(fan)應，並進(jin)行(xing)軟件(jian)分(fen)析。反應參數如下： 50°C 初始孵育(yu) 2 分鐘；在(zai) 95 °C 下初始變性(xing) 10 分(fen)鐘(zhong)；在(zai) 95 °C 15 秒和(he) 60 °C 1 分鐘下進行 35 個(ge) PCR 循(xun)環。陽性(xing)反(fan)應定義為循環閾值(zhi)（CT ) < 30 對(dui)於(yu) 50 ng DNA 模(mo)板(ban)/反應。每次運(yun)行(xing)都(dou)包含(han)陰(yin)性(xing)對(dui)照反應（無 DNA 模板(ban)）。實驗結果(guo)與乳(ru)膠(jiao)凝(ning)集(ji)進(jin)行(xing)比(bi)較(jiao)。通過對(dui)比(bi)實驗發(fa)現使(shi)用實時熒(ying)光(guang)定量 PCR 方(fang)案(an)檢(jian)測到預測序列(lie)，並且與(yu)任何(he)其他血清型引(yin)物/探(tan)針組(zu)合沒(mei)有陽性(xing)反(fan)應。而後(hou)通過乳(ru)膠(jiao)凝(ning)法(fa)集(ji)確(que)認(ren)了 47 株菌株的(de)血(xue)清型，由此(ci)驗證基於 PCR 的方(fang)法(fa)和(he)乳(ru)膠(jiao)凝(ning)集(ji)方(fang)法(fa)的(de)血(xue)清分型結果(guo)無差(cha)異。
 實驗方法(fa)對(dui)比(bi)
我(wo)們(men)知道用於 GBS 血(xue)清分型技術的(de)基於非核(he)酸(suan)的(de)實(shi)驗室方(fang)法(fa)成(cheng)本(ben)較(jiao)高，並且需要高滴(di)度的(de)血清型特異性(xing)抗(kang)血(xue)清，並且會阻礙(ai) GBS 血(xue)清型流行率(lv)的(de)研究。而乳(ru)膠(jiao)凝(ning)集(ji)試(shi)劑盒(he)可若(ruo)用於實(shi)驗室的(de) GBS 血清分型，其價(jia)格也(ye)較(jiao)貴。通過分子莢(jia)膜(mo)分(fen)型技術，包括(kuo)多(duo)重 PCR   全(quan)基因(yin)組(zu)序列(lie)的靶向分(fen)析新可(ke)用的序(xu)列(lie)信息(xi)的(de)適(shi)應性(xing)和(he)相(xiang)對(dui)容易的(de)性(xing)能(neng)，但(dan)僅能分(fen)血清型 Ia、Ib 和 III 三種血(xue)清型。

   與許多(duo)現有(you)方法(fa)不(bu)同(tong)，實(shi)時 PCR 法(fa)的(de)血(xue)清分型不是(shi)基於操作(zuo)員(yuan)對(dui)生化反應的解釋(shi)，它允(yun)許(xu)特異性(xing)鑒(jian)定 GBS 血清型，盡(jin)管(guan)會受(shou)到(dao)其他細(xi)菌 DNA 的幹擾，但(dan)它可能(neng)在(zai)流行(xing)病(bing)學(xue)研究的背(bei)景(jing)下(xia)比(bi)較(jiao)有(you)用，作(zuo)為現有(you)多(duo)重 PCR 檢(jian)測的替代方法(fa)。隨(sui)著進壹(yi)步(bu)的(de)發(fa)展，這種新方法(fa)可(ke)以(yi)直(zhi)接從標本中(zhong)檢(jian)測 GBS 血清型，而無需培(pei)養(yang)。這種方法(fa)基於實時 PCR 的(de)血清分型雖(sui)然便捷(jie)，但(dan)檢測由於需要特定的引(yin)物-探(tan)針組(zu)所以(yi)暫時無(wu)法(fa)直(zhi)接識(shi)別新的(de)血(xue)清型。

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