如何分(fen)析定(ding)量PCR實驗(yan)中(zhong)的(de)Ct值與(yu)Cq 值?

在(zai)進行定(ding)量(liang)PCR實驗(yan)時(shi)，實驗(yan)數據(ju)中(zhong)的(de)C t值是至關重(zhong)要(yao)的。今(jin)天將(jiang)帶(dai)您了解 Ct值在(zai) qPCR 中(zhong)的(de)關鍵作用(yong)、及(ji)其計算(suan)方式(shi)和(he)分(fen)析統(tong)計方法。

C t值多(duo)重名稱(cheng)
在(zai)我(wo)們(men)深(shen)入(ru)解釋什(shen)麽是 Ct 值之(zhi)前(qian)，我(wo)們(men)想花(hua)點(dian)時(shi)間強(qiang)調壹(yi)下(xia)，多(duo)年(nian)來該值已被賦(fu)予(yu)多(duo)個名稱(cheng)，包(bao)括：
C t – 閾值循(xun)環
C p – 交(jiao)叉(cha)點
TOP——起(qi)飛點
C q – 量化(hua)周(zhou)期
這(zhe)些(xie)值都(dou)是壹(yi)樣(yang)的(de)，只(zhi)是名稱(cheng)不(bu)同(tong)。為(wei)了規範(fan)qPCR的命名法(fa)，壹(yi)般(ban)標(biao)準(zhun)實驗(yan)中(zhong)會(hui)使(shi)用(yong)Cq值。

什(shen)麽是 C q值？
定量PCR實驗(yan)通(tong)常用(yong)於量(liang)化(hua)目(mu)標(biao)序(xu)列(lie)的(de)絕(jue)對量或比(bi)較樣(yang)本之(zhi)間目(mu)標(biao)序(xu)列(lie)的(de)相(xiang)對量。該技術通(tong)過放(fang)大(da)過(guo)程中(zhong)發出(chu)的目(mu)標(biao)特異(yi)性熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)實時監(jian)測目(mu)標(biao)的(de)擴(kuo)增。
盡管實時熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang)PCR中(zhong)， 熒(ying)光(guang)染料(liao)和探(tan)針(zhen) 應(ying)該是序列特異(yi)性的，但(dan)在(zai)大(da)多(duo)數實時 PCR 實驗(yan)中(zhong)會(hui)出(chu)現大(da)量(liang)的背景熒(ying)光(guang)。通(tong)過閾值線(xian)和(he) C t值可以輕松分(fen)析背(bei)景中(zhong)的(de)熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)，了解 PCR的循(xun)環周(zhou)期。其實，所謂的閾值線(xian)是檢測水(shui)平或反應(ying)達(da)到(dao)高(gao)於(yu)背(bei)景水(shui)平的(de)熒(ying)光(guang)強(qiang)度(du)的(de)點(dian)。在(zai)進行 PCR 之(zhi)前(qian)，您（或您(nin)的 PCR 儀中(zhong)的(de)軟件）設置了壹(yi)個閾值水平。這(zhe)實際上(shang)是圖(tu)表(biao)中(zhong)的(de)壹(yi)條(tiao)線(xian)，代表(biao)高(gao)於背景熒(ying)光(guang)的(de)水(shui)平，它(ta)也(ye)在(zai)指數階段開始(shi)時(shi)與(yu)反應(ying)曲(qu)線(xian)相(xiang)交(jiao)（圖(tu) 1）。
C q值是您的樣(yang)品(pin)反應(ying)曲(qu)線(xian)與(yu)閾值線(xian)相(xiang)交(jiao)處(chu)的 PCR 循(xun)環數。該值表(biao)明從(cong)您的(de)樣本中(zhong)檢測到(dao)真(zhen)實信號(hao)需要多(duo)少個周(zhou)期。實時 PCR 運(yun)行將(jiang)具有每(mei)個樣品(pin)的反應(ying)曲(qu)線(xian)，因(yin)此會(hui)有許(xu)多(duo) C q 值。您的 PCR 儀軟件會(hui)計(ji)算(suan) 每(mei)個樣品(pin)的 Cq值並(bing)繪(hui)制(zhi)圖(tu)表(biao)。

(實時 PCR 擴(kuo)增曲(qu)線(xian)上(shang)的閾值水平和(he) C q 值)
C q 值與(yu)樣本(ben)中(zhong)目(mu)標(biao)核(he)酸的數量成(cheng)反比，並(bing)與(yu)樣本(ben)中(zhong)的(de)目(mu)標(biao)拷貝數相關(guan)。較低(di)的 C q值（通(tong)常低(di)於 29 個循(xun)環）表(biao)示(shi)大(da)量(liang)的目(mu)標(biao)序(xu)列(lie)。較(jiao)高(gao)的 C q 值（超過 38 個循(xun)環）意(yi)味(wei)著較(jiao)低(di)的目(mu)標(biao)核(he)酸量。高 C q值也(ye)可(ke)能(neng)表(biao)明目(mu)標(biao)或 PCR 設置存在(zai)問(wen)題，如本文後(hou)面的陷(xian)阱(jing)部分(fen)所述。

您的 PCR 儀器將(jiang)在(zai)每(mei)個循(xun)環中(zhong)收集熒(ying)光(guang)數據(ju)。大(da)約(yue) 15 個循(xun)環後(hou)，您將(jiang)對背(bei)景(jing)熒(ying)光(guang)水(shui)平有壹(yi)個很好(hao)的了解 ——這將顯示(shi)為壹(yi)條(tiao)從(cong)零(ling)循(xun)環點(dian)開始(shi)的(de)直(zhi)線(xian)。閾值水平將(jiang)剛(gang)好(hao)高於(yu)此水(shui)平，但(dan)在(zai)您的樣品(pin)開始(shi)進入(ru) PCR 擴增指數階段時。今(jin)天，計(ji)算(suan)機(ji)軟件可以計(ji)算(suan)出(chu)這個確切的點，所有現代實時循(xun)環儀都(dou)有壹(yi)個自(zi)動閾值線(xian)設置。

實時 PCR 記(ji)錄反應(ying)過程(cheng)中(zhong)發出(chu)的熒(ying)光(guang)量(liang)，此時(shi)所有 PCR 成(cheng)分(fen)都(dou)非常(chang)豐(feng)富(fu)。這(zhe)樣(yang)，C q  值通(tong)常在(zai)實時 PCR 中(zhong)的(de)重復(fu)之(zhi)間保持(chi)壹(yi)致(zhi)。當達(da)到(dao) PCR 反應(ying)終點(dian)時，積累的抑(yi)制劑(ji)、失(shi)活的聚(ju)合酶和限(xian)制性試劑(ji)會(hui)在(zai)終點值上(shang)產生很多(duo)變化(hua)，這就(jiu)是傳統 PCR 無法(fa)定(ding)量(liang)使(shi)用(yong)的(de)原(yuan)因。

影(ying)響Cq值的相關因素(su)有哪(na)些(xie)？
許(xu)多(duo)因素(su)會(hui)影(ying)響(xiang)您(nin)的 C q 值。 您的樣品(pin)之(zhi)間C q 值的壹(yi)些(xie)差(cha)異將是由於生物事(shi)件，例如(ru)您(nin)的目(mu)標(biao)基(ji)因(yin)響(xiang)應(ying)治(zhi)療而(er)上(shang)調/下(xia)調。然而(er)，C q 值同(tong)樣(yang)容(rong)易(yi)受到 PCR 反應(ying)準備(bei)和 PCR 組分(fen)本身(shen)的影響。比較常(chang)見的(de)是以下幾(ji)種(zhong)情(qing)況(kuang)：
1. 主混音
溶液(ye)中(zhong)的(de) pH 值和鹽濃(nong)度(du)會(hui)影(ying)響(xiang)熒(ying)光(guang)發射。熒(ying)光(guang)發射的(de)任何變化(hua)都(dou)會(hui)自(zi)然地改變您(nin)的(de) C q值。因此，請(qing)確保您(nin)只使(shi)用(yong)高(gao)質量的 PCR 組件，如(ru)果(guo)使用自(zi)制(zhi)溶(rong)液(ye)，請(qing)在(zai)每(mei)次(ci)實驗(yan)前(qian)檢查(zha) pH 值並(bing)監(jian)測鹽沈(chen)澱(dian)。
2. 被動參考染料(liao)
反應(ying)值是您的 FAM（報(bao)告(gao)基因）染料(liao)與(yu)您的(de) ROX（被動參考）染料(liao)的熒(ying)光(guang)比(bi)率(lv)。假設 FAM 熒(ying)光(guang)不(bu)變(bian)，較(jiao)低(di)量的 ROX 會(hui)產(chan)生較(jiao)高(gao)的反應(ying)值。
3. 反應(ying)效(xiao)率(lv)
PCR 反應(ying)效(xiao)率(lv)取決(jue)於預(yu)混液(ye)性能、引(yin)物的特異(yi)性、引(yin)物退火溫(wen)度(du)和(he)樣(yang)品(pin)質量(liang)。壹(yi)般(ban)來說(shuo)，90% 以(yi)上(shang)的 PCR 效(xiao)率(lv)是可以接(jie)受的。* 的(de) PCR 效(xiao)率(lv)表(biao)明感興趣的目(mu)標(biao)序(xu)列(lie)在(zai)每(mei)個循(xun)環中(zhong)加(jia)倍。 PCR 效(xiao)率(lv)與(yu)模板(ban) 10 倍稀(xi)釋之(zhi)間 3.3 個循(xun)環的(de)變化(hua)相吻合。
要確定每(mei)個引(yin)物對的 PCR 效(xiao)率(lv)，請使(shi)用五個 10 倍稀(xi)釋步(bu)驟(zhou)對模(mo)板進行系(xi)列稀(xi)釋，並(bing)計算(suan) R 2 ，這是壹(yi)種(zhong)描述壹(yi)個值預(yu)測另(ling)壹(yi)個值的統計量度(du)。對(dui)於(yu)接(jie)近(jin) 100% 的(de) PCR 效(xiao)率(lv)，您的(de) R 2 值應(ying)大(da)於(yu) 0.99。
對標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)上(shang)的每(mei)個點至少運(yun)行三(san)個重復。對於(yu)低(di)拷貝數輸入(ru)，更高的重復數尤(you)其重要(yao)，因為(wei)重(zhong)復(fu)數之(zhi)間的變(bian)化(hua)更有可(ke)能(neng)發生。

4. 其他問(wen)題
假設您已經排(pai)除了上(shang)述 3 個因素(su)，導(dao)致(zhi) C q 值晚的常見原(yuan)因可(ke)能是：
模板太(tai)少(shao) - 嘗(chang)試使(shi)用(yong)更(geng)多(duo)模板。
次(ci)優(you)的(de)核(he)酸分(fen)離(li)——考(kao)慮(lv)您(nin)的(de)核(he)酸分(fen)離(li)方(fang)案(an)，量(liang)化(hua)您的 DNA，運(yun)行瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠(jiao)，嘗(chang)試其他方(fang)案/ 試劑(ji)盒。
cDNA 合成過程(cheng)中(zhong)逆(ni)轉(zhuan)錄酶(mei)活性較差(cha)——逆轉(zhuan)錄酶(mei)對降解敏感。訂購壹(yi)個新的。
RNA/cDNA 降解(jie)——保持(chi)您的(de)工(gong)作(zuo)空間清潔(jie)，改善您(nin)的(de)RNA 處(chu)理行為(wei) ，避(bi)免 cDNA 的(de)多(duo)次(ci)凍(dong)融循(xun)環。
PCR抑(yi)制。

另(ling)外，其他原(yuan)因也(ye)同(tong)樣(yang)會(hui)影(ying)響(xiang)定(ding)量PCR 的(de)Cq值，包(bao)括細(xi)胞系(xi)/培(pei)養物中(zhong)的(de)感染或汙(wu)染，但(dan)這些(xie)問(wen)題通(tong)常在(zai)核(he)酸分(fen)離(li)之(zhi)前(qian)被發現。更多(duo)PCR相關問(wen)題可以進入(ru)蘇州阿(e)爾法生物實驗(yan)器(qi)材(cai)有限(xian)公司(si)進行咨(zi)詢(xun)或留(liu)言。