GFP抗(kang)體應用中的(de)常見問(wen)題(ti)有(you)哪些

GFP抗(kang)體應用中的(de)常見問(wen)題(ti)有(you)哪些？

標簽：抗(kang)體  蛋(dan)白質結構(gou) 科(ke)學  科(ke)普 GFP抗(kang)體

   GFP適(shi)合於蛋(dan)白質標記，這(zhe)是該抗(kang)體的(de)天(tian)然(ran)優勢(shi)。雖然(ran)它非(fei)常(chang)適(shi)合實時(shi)成像，例(li)如(ru)，作為(wei) TP53 MITE-seq 屏(ping)幕(mu)的(de)報告器，其(qi)他(ta)應用導(dao)致 GFP 熒光(guang)猝(cu)滅(mie)，這使得(de)有必(bi)要使用抗(kang) GFP 抗(kang)體。組織樣本的(de)冷(leng)凍(dong)保存、組織學制(zhi)備和固(gu)定(ding)劑的(de)使用通常(chang)會(hui)導(dao)致 GFP 熒光(guang)*或(huo)部(bu)分喪(sang)失，因此需要使用抗(kang) GFP 抗(kang)體來獲(huo)得(de)可靠(kao)的(de)結果(guo)。

  通過(guo)蛋(dan)白質印(yin)跡檢(jian)測 GFP 標記的(de)蛋白質和通過(guo)免(mian)疫沈(chen)澱研(yan)究(jiu)蛋(dan)白質 -蛋白質相互(hu)作(zuo)用也需要使用 GFP 抗(kang)體。抗(kang)GFP抗(kang)體可(ke)用作多(duo)克(ke)隆(long)或單克(ke)隆抗(kang)體，適(shi)用於在(zai)蛋白質印(yin)跡、免(mian)疫沈(chen)澱、免(mian)疫組織化學、免(mian)疫細胞化學定(ding)位(wei)和免(mian)疫吸(xi)附測定(ding) (ELISA) 上(shang)檢測 GFP、GFP 變(bian)體和 GFP 融合蛋白。

GFP的(de)分子結構(gou)與(yu)特(te)征(zheng)

GFP 形(xing)成壹個(ge)比(bi)較穩(wen)定(ding)的(de)桶形結構(gou)，由(you)圍(wei)繞(rao)中(zhong)央 α 螺(luo)旋(xuan)的(de) 11 個 β折疊組成。β 表通(tong)過(guo)富(fu)含脯氨(an)酸的(de)環連(lian)接。每(mei)個片(pian)層(ceng)中的(de)氨基酸側鏈(lian)交(jiao)替(ti)突出(chu)到(dao)蛋(dan)白質內部(bu)或(huo)從(cong)表(biao)面(mian)向(xiang)外(wai)突(tu)出(chu)。GFP 發(fa)色團(tuan)由(you) Ser65、Tyr66 和 Gly67 的(de)分子內(nei)環化形(xing)成，它幾乎位(wei)於環 的(de)中心(xin)。盡管(guan)這(zhe)三個(ge)氨(an)基酸基序(xu)在(zai)自(zi)然(ran)界中很(hen)常見，但(dan)它不(bu)會(hui)產(chan)生熒(ying)光(guang)。

    正(zheng)是 GFP β-*的(de)內部(bu)環境(jing)產(chan)生了發(fa)色團(tuan)並(bing)保護它免(mian)於猝(cu)滅(mie)。發色團(tuan)的(de)形成是自(zi)催(cui)化的(de)。GFP 以 Max激發(fa)波(bo)長為(wei) 395 nm 的(de)主要質子化狀(zhuang)態(tai)和具有 475 nm 激(ji)發(fa)峰的(de)不(bu)那麽普遍的(de)非(fei)質子化狀(zhuang)態(tai)存在(zai)。兩種形式(shi)的(de)熒光發(fa)射(she)均在(zai) 510 nm 處(chu)達到(dao)峰值(zhi)。

抗(kang) GFP 抗(kang)體是(shi)否(fou)也(ye)識(shi)別 GFP 的(de)變體？

抗(kang) GFP 抗(kang)體可(ke)識(shi)別 Aequorea victoria GFP 的(de)其(qi)他(ta)變(bian)體。

為(wei)什(shen)麽(me)在(zai)蛋白質印(yin)跡上(shang)沒有(you)抗(kang) GFP 抗(kang)體的(de)信號？

蛋(dan)白質印(yin)跡後(hou)缺乏(fa)信號可(ke)能表(biao)明存(cun)在(zai)壹些(xie)不(bu)同(tong)的(de)問(wen)題(ti)。沒有(you)或非(fei)常(chang)差(cha)的(de)傳輸意(yi)味著(zhe)沒有(you)信號。可(ke)以通過(guo) Ponceau-S 染色檢(jian)查缺乏良好的(de)膜轉(zhuan)移。氣(qi)泡的(de)存在(zai)也會(hui)導(dao)致轉(zhuan)印(yin)不(bu)良。GFP 標記蛋(dan)白的(de)表達水(shui)平可能(neng)太(tai)低。加(jia)載更(geng)大(da)體積(ji)的(de)樣品並(bing)包括(kuo)陽(yang)性(xing)對照(zhao)。非(fei)常(chang)稀(xi)釋(shi)的(de)抗(kang)體可(ke)能(neng)是問(wen)題(ti)所在(zai)，嘗試(shi)使用幾種(zhong)不(bu)同(tong)濃度的(de)抗(kang)體來探(tan)測蛋(dan)白質印(yin)跡。此外(wai)，壹(yi)種(zhong)遙(yao)遠(yuan)的(de)可能性(xing)是 GFP 標簽超(chao)出幀並(bing)且未(wei)表達，導(dao)致缺少(shao)任何(he)信(xin)號。

GFP信(xin)號太(tai)弱(ruo)無(wu)法(fa)成像，可(ke)以增(zeng)強(qiang)信(xin)號嗎？

在(zai)某些(xie)實(shi)驗條件下(xia)，GFP 熒光會(hui)部(bu)分或*丟(diu)失。因此，壹(yi)些(xie)表達 GFP 標記蛋(dan)白的(de)細胞結構(gou)可(ke)能(neng)難(nan)以可視(shi)化或(huo)成像。 GFP-Booster 是(shi)壹(yi)種(zhong)源(yuan)自(zi)駱(luo)駝科動(dong)物的(de) VHH 結構(gou)域結合蛋白，與(yu)強(qiang)熒(ying)光(guang)染料(liao)偶(ou)聯(lian)。這穩(wen)定(ding)並(bing)增(zeng)強(qiang)了熒(ying)光信號。

為(wei)什(shen)麽(me)用抗(kang) GFP抗(kang)體進(jin)行免(mian)疫沈(chen)澱後會(hui)觀察(cha)到(dao)多(duo)個條帶？

抗(kang)體交(jiao)叉(cha)反應是(shi)壹(yi)個常(chang)見問(wen)題(ti)，通(tong)常(chang)會(hui)導(dao)致比預(yu)期(qi)更(geng)多(duo)的(de)條帶。更(geng)嚴(yan)格(ge)的(de)實驗條件可能會(hui)解(jie)決(jue)這(zhe)個(ge)問(wen)題(ti)。GFP-Trap 可(ke)用於免(mian)疫沈(chen)澱實驗。GFP-Trap 是(shi)壹(yi)種(zhong)單域抗(kang)體（源(yuan)自(zi)駱(luo)駝科動(dong)物），具有更(geng)高(gao)的(de)特異(yi)性(xing)、穩定(ding)性(xing)和親和力。然(ran)而，必(bi)須考慮到(dao)，如(ru)果(guo)產(chan)生了截(jie)短的(de)融合蛋白，如(ru)果(guo)存在(zai)標簽，這(zhe)些也將(jiang)被抗(kang)體檢(jian)測到(dao)，並(bing)導(dao)致多個(ge)條帶。

 蘇(su)州阿(e)爾(er)法(fa)生(sheng)物實驗器材(cai)有(you)限公(gong)司(si)長期供應生(sheng)物實驗室(shi)儀(yi)器設備及生(sheng)物試劑(ji)，其(qi)中(zhong)抗(kang)體包(bao)括(kuo)abcam/Thermo Fisher等(deng)抗(kang)體