ATCC 細胞系(xi)原代(dai)細胞培養(yang)技術

標(biao)簽：細胞系(xi) 原代(dai)培養(yang)   動物(wu)細胞培養(yang)  細胞培養(yang)

ATCC 細胞系(xi)和雜(za)交(jiao)瘤(liu)在幹冰(bing)上(shang)冷凍在冷凍(dong)保(bao)存小瓶(ping)中(zhong)運(yun)輸，或在環境(jing)溫(wen)度下作為(wei)培養(yang)瓶中(zhong)的(de)細胞培養(yang)生長(chang)物(wu)的(de)運(yun)輸。收(shou)到冷(leng)凍細胞後，重要(yao)的是要(yao)立(li)即(ji)通(tong)過(guo)解凍和去除(chu) DMSO 並(bing)將(jiang)它(ta)們(men)放入培養(yang)物(wu)中(zhong)來(lai)恢(hui)復它們(men)。如(ru)果(guo)這是不(bu)可(ke)能的，請(qing)將細胞儲存在液氮(dan)蒸氣(qi)中(zhong)（低(di)於 -130°C ）。不(bu)要(yao)將冷凍(dong)細胞儲存在 -130°C 以上(shang)的(de)溫(wen)度，因(yin)為(wei)它們的(de)活力(li)會迅(xun)速(su)下降(jiang)。

培養(yang)基的制備(bei)

通(tong)過組裝(zhuang)適當(dang)的培養(yang)基、血清(qing)和生長所需的其(qi)他(ta)試劑，為(wei)恢復細胞系(xi)做好準備。這些產(chan)品中(zhong)有許(xu)多(duo)可(ke)從 ATCC 獲得(de)，並(bing)且(qie)可(ke)以與(yu)細胞系(xi)壹(yi)起(qi)訂(ding)購(gou)。這些試劑與 ATCC 用於細胞生長和保(bao)存的試劑相(xiang)同(tong)。 雖(sui)然(ran)大(da)多(duo)數(shu)細胞系(xi)可(ke)以在壹(yi)種以(yi)上的(de)培養(yang)基中(zhong)復制，但(dan)當(dang)培養(yang)基改變時，它們(men)的特(te)性(xing)可(ke)能會改變。因(yin)此(ci)，建(jian)議(yi)在 ATCC 使用的(de)相(xiang)同(tong)培(pei)養(yang)基中(zhong)開(kai)始(shi)細胞培養(yang)以獲得(de)最(zui)佳結(jie)果(guo)（參(can)見產品信(xin)息表和 ATCC 網站）。

ATCC 細胞系(xi)的培養(yang)

1.準備壹(yi)個(ge)培養(yang)容器(qi)，使其(qi)包(bao)含產(chan)品表中(zhong)列(lie)出(chu)的(de)推(tui)薦體(ti)積(ji)的(de)適當(dang)培養(yang)基，並針(zhen)對(dui)溫(wen)度和 pH 值 (CO 2 ) 進行平(ping)衡(heng)。

2.在 37°C 或該細胞系(xi)的正常(chang)生長(chang)溫(wen)度的水浴中(zhong)輕輕攪(jiao)拌，解凍小(xiao)瓶。解凍應(ying)該很快(kuai)，大(da)約 2 分鐘(zhong)或直到冰(bing)晶(jing)融化。

3.從水(shui)浴中(zhong)取(qu)出小瓶並通過(guo)浸入(ru)或噴灑 70% 乙醇來(lai)凈化(hua)它。在層流(liu)組織培(pei)養(yang)罩(zhao)中(zhong)遵(zun)循嚴格的(de)無菌條(tiao)件(jian)進(jin)行所有進壹(yi)步(bu)操(cao)作。

4.擰開(kai)小(xiao)瓶的頂(ding)部(bu)，將(jiang)內容物(wu)轉(zhuan)移到含有 9 mL 推薦(jian)培(pei)養(yang)基的無菌離心(xin)管中(zhong)。通(tong)過(guo)溫(wen)和離心(xin)（125 × g 下 10 分鐘(zhong)）除(chu)去冷凍(dong)保(bao)護劑 (DMSO)。

5.丟(diu)棄(qi)上清(qing)液，將(jiang)細胞重新懸浮在 1 或 2 毫升(sheng)的(de)*生長培養(yang)基中(zhong)。將(jiang)細胞懸浮液轉(zhuan)移到含有*生長(chang)培(pei)養(yang)基的培養(yang)容器(qi)中(zhong)，輕輕搖(yao)動*混合。

6.在24 小時後檢查細胞培養(yang)物(wu)，並(bing)根(gen)據(ju)需要(yao)進行繼代(dai)培(pei)養(yang)。這裏(li)需要(yao)註(zhu)意(yi)的(de)是壹(yi)些細胞系(xi)，例(li)如(ru)雜(za)交(jiao)瘤(liu)，需要(yao)幾(ji)天(tian)時間才能從冷(leng)凍(dong)保(bao)存中(zhong)*恢(hui)復。壹(yi)些雜(za)交(jiao)瘤(liu)在培養(yang)的第(di)壹(yi)天(tian)存活率(lv)很低(di)，會產生細胞碎片(pian)。在此之(zhi)後(hou)，細胞培養(yang)將開(kai)始恢(hui)復並進(jin)入(ru)指數(shu)增(zeng)長(chang)。

處理搖(yao)瓶(ping)內(nei)的培(pei)養(yang)物(wu)

壹(yi)些 ATCC 細胞作為(wei)培養(yang)容器(qi)中(zhong)的(de)生(sheng)長(chang)培養(yang)物(wu)運(yun)輸。這些容(rong)器(qi)中(zhong)接(jie)種細胞，培養(yang)以確保(bao)細胞生長，然(ran)後(hou)*填(tian)充培(pei)養(yang)基以進行運(yun)輸。

收(shou)到搖(yao)瓶培養(yang)物(wu)後(hou)，目視(shi)檢查培(pei)養(yang)基是否有微(wei)生(sheng)物(wu)汙染(ran)的(de)宏(hong)觀(guan)證(zheng)據(ju)。這包括(kuo)不尋常(chang)的 pH 值變化(hua)（酚(fen)紅(hong)呈(cheng)黃(huang)色(se)或紫(zi)色）、濁度或顆粒。使用低(di)倍（100 倍）倒(dao)置顯(xian)微(wei)鏡(jing)檢查培(pei)養(yang)基中(zhong)是否有微(wei)生(sheng)物(wu)汙染(ran)的(de)證(zheng)據(ju)以(yi)及(ji)細胞的形(xing)態(tai)。

如(ru)果(guo)細胞附(fu)著(zhe)並(bing)以(yi)單(dan)層生(sheng)長(chang)：

需要(yao)以無菌方式去除(chu)除(chu) 5 mL 至(zhi) 10 mL 外的(de)所有運(yun)輸介質(zhi)。運(yun)輸介質(zhi)可(ke)以保(bao)存以備(bei)重復使用，並(bing)應(ying)儲(chu)存在 4°C。

在產品說明書中(zhong)推(tui)薦(jian)的(de)溫(wen)度和 CO 2濃度下（37°C，大(da)多(duo)數(shu)細胞系(xi)為(wei)5% CO 2 ）孵(fu)育培養(yang)瓶，直到細胞傳代。

如(ru)果(guo)細胞未附(fu)著(zhe)或懸浮生(sheng)長(chang)：

將(jiang)搖(yao)瓶中(zhong)的(de)全(quan)部(bu)內(nei)容物(wu)無(wu)菌轉移到離(li)心(xin)管中(zhong)。

以(yi) 125 × g 離(li)心(xin) 5 到 10 分鐘(zhong)。

除(chu)去 10 mL 的運(yun)輸介質(zhi)上清(qing)液，然(ran)後(hou)重(zhong)新懸浮細胞。將此培(pei)養(yang)基的剩余(yu)部(bu)分儲存在 4°C 以備(bei)後(hou)用。

根(gen)據(ju)細胞系(xi)，將重懸的(de)細胞無菌轉移到 25-cm 2燒(shao)瓶(ping)或 75-cm 2燒(shao)瓶(ping)中(zhong)（參(can)見產品表）。

在產品信(xin)息表中(zhong)推(tui)薦(jian)的(de)溫(wen)度和 CO 2濃度下孵(fu)育細胞，直到細胞進行傳代培養(yang)。

原代(dai)細胞的特點(dian)

由於大(da)多(duo)數(shu)細胞系(xi)都是從壹(yi)塊(kuai)切(qie)碎(sui)或酶分散的(de)組織開(kai)始(shi)的(de)原代(dai)培養(yang)物(wu)。原代(dai)培養(yang)物(wu)是幾(ji)種細胞類(lei)型的混(hun)合物(wu)，保(bao)留了(le)其(qi)源(yuan)組織的(de)特(te)征(zheng)。

壹(yi)段(duan)時間後(hou)，原代(dai)培養(yang)物(wu)將(jiang)達(da)到匯合，即(ji)由於細胞膨脹(zhang)而(er)覆(fu)蓋(gai)培(pei)養(yang)容器(qi)的所有可(ke)用空(kong)間的(de)狀態(tai)。此(ci)時，需要(yao)將培養(yang)物(wu)分解（通常(chang)使用胰蛋(dan)白(bai)酶等蛋(dan)白(bai)水解酶）分解為(wei)單(dan)個細胞並進行繼代(dai)培(pei)養(yang)（分裂、傳(chuan)代(dai)或轉移）。在第(di)壹(yi)次(ci)傳(chuan)代(dai)之(zhi)後(hou)，培養(yang)物(wu)通(tong)常(chang)被稱(cheng)為(wei)細胞系(xi)。隨著(zhe)隨(sui)後(hou)的(de)每次(ci)傳(chuan)代(dai)，細胞群變得(de)更(geng)加均勻，因(yin)為(wei)生長速(su)度更快(kuai)的(de)細胞占主(zhu)導(dao)地(di)位。也(ye)可(ke)以通(tong)過(guo)克(ke)隆從培(pei)養(yang)物(wu)中(zhong)選出具(ju)有所需特性(xing)的(de)細胞。

二倍體(ti)細胞系(xi)很少會超過幾(ji)個(ge)種群(qun)倍增(zeng)。它(ta)們的復制能力(li)有限，在 20 到 80 次(ci)種群(qun)倍增(zeng)後(hou)開始減(jian)慢(man)並最終(zhong)停止(zhi)分裂。

1. 有證據(ju)表明，在細胞培養(yang)中(zhong)觀(guan)察(cha)到的(de)壹(yi)些細胞衰老(lao)可(ke)能是由於不(bu)適當(dang)的培養(yang)條(tiao)件(jian)，而(er)不(bu)是預先確定的(de)復制衰老(lao)。

2. 還有壹(yi)些數(shu)據(ju)支持某(mou)些物(wu)種（尤(you)其(qi)是人(ren)類(lei)）細胞的復制性(xing)衰老(lao)，即(ji)使在改進(jin)的(de)培養(yang)條(tiao)件(jian)下(xia)生(sheng)長也(ye)是如(ru)此(ci)。這種衰老(lao)是通(tong)過(guo)每次(ci)細胞分裂時染色(se)體(ti)末端（端粒）的縮(suo)短來(lai)介導(dao)的(de)。

3. 相(xiang)比(bi)之下(xia)，連續（或永生(sheng)化(hua)）細胞系(xi)具(ju)有無限(xian)的(de)復制能力(li)。這些細胞系(xi)通過永生(sheng)化(hua)或通過多(duo)種方(fang)法中(zhong)的(de)任(ren)何(he)壹(yi)種進(jin)行轉化而(er)衍(yan)生自(zi)細胞系(xi)。許(xu)多(duo)連續細胞系(xi)來源(yuan)於腫(zhong)瘤組織。ATCC 集(ji)合中(zhong)的(de)大(da)多(duo)數(shu)細胞系(xi)是連續的，但少(shao)數(shu)細胞系(xi)，例(li)如(ru) CCD-1117Sk 人(ren)類(lei)皮膚成(cheng)纖(xian)維細胞 ( ATCC CRL-2465 ) 或 CCD-18Co 人(ren)類(lei)結(jie)腸 ( ATCC CRL-1459 ) 是有限的(de)。

如(ru)培養(yang)容器(qi)部(bu)分所述(shu)，細胞系(xi)可(ke)以附(fu)著(zhe)在表面（依賴(lai)錨(mao)固(gu)）或懸浮（不(bu)依(yi)賴(lai)錨(mao)固(gu)）生長。當(dang)細胞在單(dan)層或懸浮液中(zhong)生(sheng)長(chang)和分裂時，它們(men)通常(chang)遵(zun)循由四個(ge)階段組成的(de)特征(zheng)性(xing)生(sheng)長(chang)模(mo)式：滯(zhi)後、對數(shu)或指數(shu)、靜止(zhi)或平(ping)穩(wen)期和衰退期(qi) 。

滯(zhi)後期 — 接種培(pei)養(yang)容器(qi)後，細胞立(li)即(ji)緩(huan)慢(man)生(sheng)長，同(tong)時從傳(chuan)代(dai)培養(yang)的壓力(li)中(zhong)恢(hui)復。

對數(shu)期(qi)或指數(shu)期(qi) — 細胞進入指數(shu)增(zeng)長(chang)期，持續(xu)到整(zheng)個生長(chang)表面被占(zhan)據(ju)或細胞濃度超過培養(yang)基容量。

靜止(zhi)期(qi) — 細胞增(zeng)殖減(jian)慢(man)並停止(zhi)。

衰退期(qi)——如果(guo)不(bu)更換培(pei)養(yang)基且(qie)細胞數(shu)量不減(jian)少(shao)，細胞將失去活力(li)，數(shu)量減(jian)少(shao)。

為(wei)了(le)確保(bao)活力(li)、遺傳(chuan)穩(wen)定性(xing)和表型穩(wen)定性(xing)，細胞系(xi)需要(yao)保(bao)持在指數(shu)期(qi)。這意味著(zhe)它(ta)們(men)需要(yao)在進入(ru)穩(wen)定生(sheng)長(chang)期(qi)、單(dan)層細胞匯合之(zhi)前(qian)或懸浮液達(da)到其(qi)推(tui)薦(jian)的最(zui)大(da)細胞密度之前定期(qi)傳代培養(yang)。為(wei)每個細胞系(xi)生成生長(chang)曲(qu)線(xian)有助於確定細胞系(xi)的生長特(te)性。

蘇州阿爾法生(sheng)物(wu)13年專(zhuan)註(zhu)於實(shi)驗室(shi)儀器(qi)設備及(ji)試劑耗材(cai)行業，提供(gong)的(de)細胞培養(yang)類(lei)的產品主(zhu)要(yao)涵蓋細胞罐(guan)、生物(wu)反(fan)應(ying)器(qi)、搖瓶(ping)、培養(yang)瓶、胰酶、培養(yang)基等幾(ji)十(shi)個(ge)品種，如(ru)需 ATCC 細胞系(xi)生長和繁殖的詳細信息，請參(can)閱(yue)ATCC 網站上(shang)找(zhao)到的(de)特定細胞系(xi)產品表。